Nghiên cứu cảm ứng và bước đầu nhân nuôi sinh khối rễ cây dược liệu rau đắng đất (Glinus oppositifolius L.)

Cây thuốc là nguồn nguyên vật liệu quan trọng trong ngành dược phẩm phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người trên toàn thế giới. Hiện nay, nhu cầu trên toàn cầu về các hợp chất sinh học từ cây thuốc đã tạo nên sự khai thác quá mức các cây dược liệu có giá trị. Áp dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật để sản xuất các thành phần quan trọng của các sản phẩm dược phẩm được thương mại hóa đã trở nên phổ biến trong những năm qua [1]. Quá trình nuôi cấy tế bào, mô và cơ quan của các cây dược liệu để thu nhận các hoạt chất sinh học vừa mang ý nghĩa cho ngành dược phẩm vừa mang các giá trị về kinh tế. Trong đó, hướng ứng dụng nuôi cấy rễ bất định và rễ tơ (rễ chuyển gen của vi khuẩn) được đánh giá là cách thay thế hiệu quả cho phương pháp thông thường để sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị từ cây thuốc nhờ khả năng tăng trưởng nhanh, khả năng tổng hợp cao và sự ổn định về di truyền của tế bào thực vật [2]. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, tốc độ phân chia của tế bào thực vật diễn ra nhanh hơn, tế bào có tiềm năng tích lũy hợp chất thứ cấp cao hơn và tạo ra các hoạt chất một cách ổn định nhờ các gốc tự do trong môi trường nuôi cấy [3]. Bên cạnh ưu thế về khả năng sinh trưởng và tích lũy, quá trình nuôi cấy rễ càng được dễ dàng ứng dụng hơn với sự phát triển về công nghệ bioreactor. Hiện nay, có rất nhiều cây thuốc được ứng dụng theo hướng tiếp cận này và đã nuôi cấy thành công, cung cấp nguyên liệu cho các sản phẩm thương mại hóa [2].

Cây Rau đắng đất (G. oppositifolius L.) là cây dược liệu thân thảo sống lâu năm thuộc họ Rau đắng (Molluginaceae), cây có chiều cao tối đa 40-50 cm [4]. Cây thường được tìm thấy ở các vùng đất cát ở các nước nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới như Ấn Độ, Pakistan, Phillipine, Mali, Thái Lan, Việt Nam và Trung Quốc hoặc vùng Đông Phi từ Senegal tới Nam Nigeria [5]. Cây Rau đắng đất là cây thuốc quý chứa các hoạt chất sinh học như saponin, flavonoid, carbohydrate, và một số hợp chất thơm khác [6]. Đặc biệt chất spinasterol, được phân lập từ rễ cây Rau đắng đất, có tiềm năng điều trị các bệnh thoái hoá thần kinh gây ra bởi stress oxy hoá và viêm thần kinh, tiềm năng trong điều trị các bệnh tiểu đường loại 2 [7]. Hơn nữa, có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, có nhiều hợp chất khác nhau trong cây Rau đắng đất như benzoic axit [8], trans-ferulic axit [9], vanillin, stigmasterol, spinasterol, β-sitosterol [10], vitexin, vicenin, kaempferol đã được chứng minh ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư [4]. Từ lâu, loại dược liệu này được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền của nhiều quốc gia và hiện nay được nghiên cứu và áp dụng nhiều trong y học hiện đại. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu cây Rau đắng đất hiện nay sử dụng đều từ thu hái tự nhiên. Do đó, con người khó chủ động về nguồn vật liệu phục vụ cho nhu cầu của mình. Rễ cây Rau đắng đất được xác định là bộ phận tích lũy nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả lần đầu tiên thử nghiệm cảm ứng tạo rễ bất định của cây Rau đắng đất trong điều kiện in vitro và xác định một số nhân tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy sinh khối. Vật liệu để cảm ứng rễ được sử dụng là chồi đỉnh và mô lá cây Rau đắng đất in vitro.

Cảm ứng rễ in vitro

Kết quả nghiên cứu cho thấy hai hợp chất auxin IBA, α-NAA ở các nồng độ khác nhau kích thích sự ra rễ và hình thái rễ của chồi in vitro và mô lá cây Rau đắng đất (Bảng 1, Bảng 2). So sánh kết quả thí nghiệm về cảm ứng rễ cảm ứng từ chồi, mô lá in vitro cây Rau đắng đất bằng chất điều hòa sinh trưởng auxin cho thấy rễ cảm ứng có nguồn gốc từ chồi cho tỷ lệ rễ đạt 100% ở tất cả các công thức, còn rễ cảm ứng có nguồn gốc từ lá chỉ có các công thức bổ sung kết hợp IBA, α-NAA và công thức bổ sung riêng rẽ 0,5mg/l α-NAA cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%. Rễ cảm ứng có nguồn gốc từ chồi cho rễ to và mập, còn rễ cảm ứng từ lá cho rễ nhỏ và mảnh hơn (Hình 1, Hình 2).

Bảng 1. Ảnh hưởng của hợp chất auxin đến khả năng tạo rễ từ chồi in vitro cây Rau đắng đất (sau 28 ngày nuôi cấy)

Ghi chú: TB: trung bình. Môi trường nền MS + 30 g/l sucrose. Mẫu ra rễ 100% ở tất cả các công thức.

 Các giá trị có chữ cái viết thường theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Hình 1. Hình thái rễ bất định của cây Rau đắng đất cảm ứng từ chồi in vitro (sau 28 ngày nuôi cấy)

 (CT1: Đối chứng, CT2: 0,25mg/l IBA, CT3: 0,5mg/l IBA, CT4: 0,75mg/l IBA,

CT5: 0,25 mg/l α-NAA, CT6: 0,5mg/l α-NAA, CT7: 0,75mg/l α-NAA)

Bảng 2. Ảnh hưởng của hợp chất auxin đến khả năng tạo rễ từ mô lá in vitro (sau 28 ngày nuôi cấy)

   Ghi chú: Môi trường nền MS + 30 g/l sucrose. Các giá trị trung bình có chữ cái viết thường theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Hình 2. Ảnh hưởng của hợp chất auxin đến sự cảm ứng rễ từ mô lá cây Rau đắng đất

(sau 28 ngày nuôi cấy)

(CT1: Đối chứng, CT2: 0,25mg/l IBA, CT3: 0,5mg/l IBA, CT4: 0,75mg/l IBA, CT5: 0,25 mg/l α-NAA, CT6: 0,5mg/l α-NAA, CT7: 0,75mg/l α-NAA, CT8: 0,25mg/l IBA+ 0,25mg/l α-NAA,

CT9: 0,5mg/l IBA+0,25mg/l α-NAA, CT10: 0,25mg/l IBA+ 0,5mg/l α-NAA, CT11: 0,5mg/l IBA+0,5mg/l α-NAA)

Ảnh hưởng các yếu tố đến điều kiện nhân nuôi rễ in vitro

Rễ bất định sau quá trình cảm ứng được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung các hợp chất auxin IAA, α -NAA ở nồng khác nhau để đánh giá tác động ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của rễ. Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung α -NAA kích thích rễ in vitro phát triển tốt hơn IAA (Bảng 3).

Bảng 3. Ảnh hưởng của IAA và α-NAA đến quá trình tăng trưởng rễ Rau đắng đất (sau 35 ngày nuôi cấy)

Ghi chú: Nền môi trường: môi trường MS + 30 g/l sucrose. Các giá trị trung bình có chữ cái viết thường theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (95%).

Ánh sáng được đánh giá là một nhân tố quan trọng trong sự điều khiển tích lũy các hợp chất sơ cấp và thứ cấp để đạt được sự tăng trưởng tối ưu của tế bào thực vật của nhiều cây dược liệu trong nuôi ấy in vitro [15]. Trong nghiên cứu này, rễ Rau đắng đất được nuôi cấy trên môi trường thích hợp trong hai điều kiện chiếu sáng là có chiếu sáng (16h sáng/8h tối) và tối hoàn toàn. Kết quả cho thấy, rễ Rau đắng đất tăng sinh khối trong điều kiện tối tốt hơn ở ngoài ánh sáng. Ở điều kiện nuôi cấy tối hoàn toàn, khối lượng rễ tăng trong 28 ngày đạt 199,37 ± 5,58 mg cao hơn so với công thức có chiếu sáng (108,24 ± 7,58 mg). Bên cạnh đó, số rễ/mẫu cấy cũng cao hơn ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn đạt 20,70 ± 2,87 rễ. Như vậy, điều kiện nuôi cấy rễ trong tối là tối ưu hơn cho sự tăng sinh khối của rễ cây Rau đắng đất.

Bảng 4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến quá trình sinh trưởng rễ cây Rau đắng đất sau 28 ngày nuôi cấy.

Ghi chú: KLG: Khối lương. Các giá trị trung bình có chữ cái viết thường theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Kết luận

Trên vật liệu cây Rau đắng đất in vitro, nghiên cứu đã xác định được một số thông số kỹ thuật như sau: Để cảm ứng rễ bất định từ chồi Rau đắng đất, môi trường MS bổ sung 0,75 mg/l α-NAA là tối ưu nhất với tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ/mẫu cấy đạt 16,13 ± 0,84 rễ, chiều dài trung bình rễ 2,60 ± 3,62 cm, rễ có màu vàng tươi và có rễ tơ. Với vật liệu từ mô lá, môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA là công thức thích hợp, rễ cảm ứng có màu vàng tươi, tỷ lệ tạo rễ đạt 100%, số rễ/mẫu cấy đạt 25,73 ± 4,95 rễ. Để nhân nuôi sinh khối rễ Rau đắng đất, môi trường MS với 0,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ ra rễ cao, số rễ/mẫu cấy đạt 13,20 ± 2,53 rễ, chiều dài trung bình rễ đạt 2,65 ± 0,40 cm. Rễ cây Rau đắng đất tăng trưởng tốt trong điều kiện nuôi cấy tối hoàn toàn. Các kết quả nghiên cứu về cảm ứng và nhân nuôi sinh khối rễ cây Rau đắng đất là các thông tin có ý nghĩa cho hướng nghiên cứu nhân nuôi sinh khối rễ cây Rau đắng đất nói riêng và cây dược liệu nói chung để thu nhận các hợp chất thứ cấp có giá trị cho ngành dược.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]  S.-L. Chen, H. Yu, H.-M. Luo, Q. Wu, C.-F. Li, and A. Steinmetz. (2016).  "Conservation and sustainable use of medicinal plants: problems, progress, and prospects," Chinese Medicine, vol. 11, no. 1, p. 37, 2016/07/30 2016.

[2]  M. J. Hussain et al. (2022).  "Root Cultures, a Boon for the Production of Valuable Compounds: A Comparative Review," (in eng), Plants (Basel), vol. 11, no. 3, Feb 5 2022.

[3]  K. W. Yu, H. N. Murthy, C. S. Jeong, E. J. Hahn, and K. Y. Paek. (2005).  "Organic germanium stimulates the growth of ginseng adventitious roots and ginsenoside production," Process Biochemistry, vol. 40, no. 9, pp. 2959-2961, 2005/09/01/ 2005.

[4]  T. Chakraborty and S. Paul. (2017).  "Glinus oppositifolius (L.) Aug. DC.: A Repository of Medicinal Potentiality," International Journal of Phytomedicine, vol. 9, p. 543, 12/28 2017.

[5]  W. H. Lewis. (1986).  "The Useful Plants of West Tropical Africa," Economic Botany, vol. 40, no. 2, pp. 176-176, 1986/04/01 1986.

[6]  S.-Y. Sheu, C.-H. Yao, Y.-C. Lei, and T.-F. Kuo. (2014).  "Recent progress in Glinus oppositifolius research," Pharmaceutical Biology, vol. 52, no. 8, pp. 1079-1084, 2014/08/01 2014.

[7]  D. Lee, J. Y. Kim, H. C. Kwon, J. Kwon, D. S. Jang, and K. S. Kang. (2022).  "Dual Beneficial Effects of α-Spinasterol Isolated from Aster pseudoglehnii on Glucose Uptake in Skeletal Muscle Cells and Glucose-Stimulated Insulin Secretion in Pancreatic β-Cells," (in eng), Plants (Basel), vol. 11, no. 5, Feb 28 2022.

[8]  C. Seidel et al. (2016).  "4-Hydroxybenzoic acid derivatives as HDAC6-specific inhibitors modulating microtubular structure and HSP90α chaperone activity against prostate cancer," Biochemical Pharmacology, vol. 99, pp. 31-52, 2016/01/01/ 2016.

[9]  Y. Fong et al. (2016).  "Inhibitory effect of trans-ferulic acid on proliferation and migration of human lung cancer cells accompanied with increased endogenous reactive oxygen species and β-catenin instability," Chinese Medicine, vol. 11, no. 1, p. 45, 2016/10/01 2016.

[10] A. B. Awad, R. Roy, and C. S. Fink. (2003).  "Beta-sitosterol, a plant sterol, induces apoptosis and activates key caspases in MDA-MB-231 human breast cancer cells," (in eng), Oncol Rep, vol. 10, no. 2, pp. 497-500, Mar-Apr 2003.

[11] S. N. Sharma, Z. Jha, and R. K. Sinha. (2013).  "Establishment of in vitro adventitious root cultures and analysis of andrographolide in Andrographis paniculata," (in eng), Nat Prod Commun, vol. 8, no. 8, pp. 1045-7, Aug 2013.

[12] E. Catapan, M. Otuki, and A. Viana. (2001).  "In vitro culture of Phyllanthus stipulatus (Euphorbiaceae)," Revista Brasileira de Botânica, vol. 24, 03/01 2001.

[13] M. Mahdieh, M. Noori, and S. Hoseinkhani. (2015).  "Establishment of In vitro Adventitious Root Cultures and Analysis of Flavonoids in Rumex crispus," Plant Tissue Culture and Biotechnology, vol. 25, 07/09 2015.

[14] P. Naik and J. Al-Khayri. (2016). "Abiotic and Biotic Elicitors–Role in Secondary Metabolites Production through In Vitro Culture of Medicinal Plants," pp. 247-277.

[15] H. Fazal, B. H. Abbasi, N. Ahmad, S. S. Ali, F. Akbar, and F. Kanwal. (2016).  "Correlation of different spectral lights with biomass accumulation and production of antioxidant secondary metabolites in callus cultures of medicinally important Prunella vulgaris L," Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 159, pp. 1-7, 2016/06/01/ 2016.

Thông tin được trích dẫn từ bài báo: Nghiên cứu cảm ứng và bước đầu nhân nuôi sinh khối rễ cây dược liệu rau đắng đất (Glinus oppositifolius L.). Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm Nghiệp Tập 13, số 2 (2024).

Link: https://journal.vnuf.edu.vn/vi/article/view/1602/1432